استفاده از تصادفی‌سازی مندلی در مطالعات اپیدمیولوژیک

مقدمه: طی دهه‌های اخیر در موارد متعددی، یافته‌های حاصل از مطالعات اپیدمیولوژیک کلاسیک که با متدهای مشاهده‌ای انجام شده بودند، نقض شده و زیر سوال قرار گرفته‌اند. در اغلب این موارد، یافته‌های علیتی گزارش شده، در اثر متغیرهای مخدوش‌کننده ایجاد شده بودند و یک رابطه حقیقی را نشان نمی‌دادند. مطالعات مشاهده‌ای فراوانی تا کنون به اجرا گذاشته شده که یک رابطه معنی‌دار علیتی بین یک مواجهه و پیامد را نشان داده، ولی این یافته‌ها با انجام یک کارآزمایی کنترل شده تصادفی (RCT ) نقض گردیده است. بااین وجود نمی‌توان از کارآزمایی‌های بالینی در بسیاری از موارد استفاده نمود، به عنوان مثال در مواردی که مواجهه مورد نظر، برای سلامتی افراد مضر بوده (مثلاً مواجهه با سموم) و یا در مواردی که اندازه‌گیری دقیق مواجهه دشوار می‌باشد (مثل جنبه‌های مختلف تغذیه). یکی از مثال‌های چنین مواردی، رابطه بین مصرف ویتامین C و کاهش بیماری‌های عروق کرونر قلب (CHD) می‌باشد. هر چند که در مطالعات مشاهده‌ای انجام شده در این خصوص، یک رابطه حفاظتی بین افزایش ویتامین C پلاسما و کاهش مرگ و میر پنج ساله ناشی از بیماری عروق کرونر قلب مشاهده گردید، ولی این نتایج پس از اجرای یک کارآزمایی کنترل شده تصادفی نقض گردید و هیچگونه رابطه معنی‌داری دیده نشد (شکل 1). شکل 1- نتایج متفاوت حاصل از مطالعات مشاهده‌ای (EPIC) و یک کارآزمایی تصادفی شده (Heart Protection Study) در خصوص اثر افزایش ویتامین C پلاسما بر مرگ و میر پنج ساله ناشی از بیماری عروق کرونر عوامل مخدوشگری که می‌توانند سبب ایجاد چنین روابط علیتی جعلی شوند می‌توانند با فاکتورهای اجتماعی-اقتصادی، عوامل رفتاری و دسترسی به خدمات بهداشتی درمانی مرتبط باشند. به عنوان مثال در مطالعه فوق‌الذکر، افرادی که به مقدار زیاد از مکمل‌های ویتامینه استفاده کرده و در نتیجه میزان ویتامین بالاتری در پلاسمای خود دارند، در بسیاری از خصوصیات و رفتارهای دیگر، با افرادی که از این مکمل‌ها استفاده نمی‌کنند متفاوت می-باشند. مفهوم تصادفی‌سازی مندلی : اساس تصادفی‌سازی مندلی، قانون دوم مندل (قانون جور شدن مستقل ژن‌ها) می‌باشد. بر طبق این قانون در هنگام تشکیل گامت‌ها جدا شدن آلل-های یک جفت آلل، مستقل از جدا شدن آلل‌های یک جفت آلل دیگر صورت می‌گیرد. بنابراین وراثت یک صفت ژنتیکی، مستقل از وراثت صفات دیگر می‌باشد (شکل 2). شکل 2- نمایش قانون دوم مندل (قانون جور شدن مستقل ژن‌ها) در مطالعات اپیدمیولوژی ژنتیک معمولی، معمولاً اختلافات ژنتیکی و فنوتیکی بین افراد یک جامعه مورد بررسی قرار گرفته تا به ریشه ژنتیکی بعضی از صفات پی برده و یا عملکرد یک ژن را مورد ارزیابی قرار داد. در صورتی که در مطالعاتی که بر اساس تصادفی‌سازی مندلی انجام می‌شود، از جور شدن مستقل ژن‌ها به منظور کنترل مخدوش‌کننده‌ها در بررسی رابطه بین یک مواجهه و پیامد استفاده می‌گردد. چنانچه در یک نقطه از زنجیره DNA در بین تعدادی از افراد یک جامعه تفاوت‌هایی وجود داشته باشد (با شیوع حداقل 1%)، به آن پلی‌مورفیسم گفته می‌شود. تصادفی‌سازی مندلی بر پایه این ایده اجرا می‌شود که چنانچه یک پلی‌مورفیسم ژنی موجب ایجاد تفاوت‌های فنوتیپی در تعدادی از افراد جامعه گردد که این تفاوت‌ها به نوعی سبب شبیه‌سازی یک مواجهه خاص شده و یا اثر یک مواجهه خاص را تغییر دهد، اگر بین وجود این پلی-مورفیسم و پیامد مورد نظر رابطه معنی‌داری مشاهده شد، رابطه بین آن مواجهه و پیامد نیز تایید می‌گردد. چند مثال از کاربرد تصادفی‌سازی مندلی: 1- فولات، هوموسیستئین و بیماری عروق کرونر قلب: مطالعات مشاهده‌ای رابطه بین مقادیر بالاتر هوموسیستئین پلاسما و افزایش خطر ابتلا به CHD را نشان داده‌اند. ضمناً کارآزمایی‌های بالینی، اثر مصرف متوسط فولات در کاهش هوموسیستئین پلاسما را تایید نموده‌اند. از آنجایی که رابطه بین هوموسیستئین و CHD ممکن است در اثر عوامل مخدوشگری چون مصرف سیگار، فاکتورهای اجتماعی اقتصادی، و یا ابتلا به آترواسکلروز ایجاد شده باشد، به منظور تایید این رابطه از تصادفی‌سازی مندلی استفاده شده است. یک پلی‌مورفیسم عملکردی سبب کاهش عملکرد آنزیم متیلن تتراهیدروفولات ردوکتاز (MTHFR) می‌شود. از آنجایی که این آنزیم در تبدیل هوموسیستئین به متیونین نقش دارد، لذا افرادی که دارای این پلی‌مورفیسم ژنتیکی می‌باشند، از میزان بالاتری از هوموسیستئین در پلاسما برخوردار هستند. به عبارت دیگر این پلی‌مورفیسم، مصرف کمتر فولات را تقلید می‌کند. افرادی که دارای آلل‌های هموزیگوت TT هستند در مقایسه با افرادی که دارای آلل‌های هموزیگوت CC هستند، به طور میانگین دارای μmol/l 6/2 هوموسیستئین بالاتری در پلاسما می‌باشند. بنابراین چنانچه یک رابطه علیتی بین هوموسیستئین و CHD وجود داشته باشد، افراد با ژنوتیپ TT در مقایسه با افراد CC باید در معرض خطر بیشتر CHD باشند. با توجه به اینکه مقایسه بین این افراد بر اساس ژنوتیپشان می‌باشد، بنا بر قانون دوم مندل امکان اندکی برای مخدوش‌شدگی وجود خواهد داشت (جدول 1) جدول 1- عدم وجود رابطه معنی‌دار بین عوامل مخدوش‌کننده بالقوه با پلی‌مورفیسم ژنتیکی و وجود رابطه معنی‌دار بین آنها و سطح هموسیستئین پلاسما در متا آنالیزی که بر روی مطالعات مشاهده‌ای انجام شده در این زمینه انجام گردید، یک خطر نسبی به مقدار 13/1 (با فاصله اطمینان 08/1 تا 19/1) برای رابطه بین μmol/l 6/2 هوموسیستئین بالاتر و CHD محاسبه گردید. در متا آنالیز دیگری که بر روی مطالعات بر پایه تصادفی‌سازی مندلی انجام گردید، یک خطر نسبی به مقدار 16/1 (با فاصله اطمینان 05/1 تا 28/1) برای افراد با ژنوتیپ TT در مقایسه با افراد CC برای خطر CHD محاسبه گردید. هر چند که نتیجه حاصل از هر دو روش یکسان می‌باشند، ولی در مطالعات انجام شده بر پایه تصادفی‌سازی مندلی، امکان مخدوش‌شدگی بسیار کمتر بوده و نتایج حاصله قابلیت اطمینان بیشتری دارند. 2- ارگانوفسفات‌ها و بیماری دامداران: در تعدادی از دامدارانی که به منظور مبارزه با انگل‌های خارجی، گوسفندان خود را در حمام ارگانوفسفاته‌ها غوطه‌ور می‌کردند، نشانه‌هایی از بیماری و کاهش سطح سلامت دیده شده است. از سوی دیگر، افرادی اظهار می‌دارند که این بیماریها غیر واقعی بوده و حربه‌ای از سوی دامداران برای دریافت خسارت از شرکت‌های بیمه و یا بازنشستگی زودتر از موعد می‌باشند. از آنجایی که انجام کارآزمایی بالینی در این خصوص، غیر ممکن می‌باشد، لذا نتیجه‌گیری قابل اطمینانی در این باره وجود ندارد و از سوی دیگر اجرای مطالعات مورد-شاهدی که فاقد سوگرایی شده باشند نیز در این خصوص بسیار دشوار می‌باشد. برای حل این مشکل، می‌توان از تصادفی‌سازی مندلی کمک گرفت. آنزیمی به نام پارا اُکساناز اجزای سمی حمام دام‌ها را غیرفعال می‌سازد. اگر ترکیباتی که توسط این آنزیم غیرفعال می‌شوند عامل بیماری دامداران باشند، بنابراین باید در بین دامدارانی که با ارگانوفسفاتها مواجهه دارند، افرادی که میزان کمتری از این آنزیم را در بدن خود دارند، به نسبت بیشتری علائم بیماری را بروز دهند. بر اساس مطالعات ژنتیکی، در بعضی از افراد به علت وجود یک پلی‌مورفیسم خاص سطح کمتری از آنزیم پارا اُکساناز (که غیرفعال کننده ارگانوفسفاتها می‌باشد) وجود دارد. در بررسی‌های انجام شده در بین دامدارانی که با ارگانوفسفاتها مواجهه داشتند، مشخص گردید که افرادی که دارای این پلی‌مورفیسم ژنتیکی خاص هستند، علائم بیماری بیشتری را نشان دادند. از آنجایی که این خصوصیت ژنتیکی تحت تاثیر عوامل مخدوش‌کننده قرار نمی‌گیرد، لذا شواهد قابل اطمینان‌تری را در خصوص اثرات سوء ارگانوفسفاتها بر سلامت افراد فراهم می‌آورد. 3- فیبرینوژن و بیماری عروق کرونر قلب: اثر فیبرینوژن پلاسما به عنوان عامل خطری برای بیماری عروق کرونر قلب مورد بحث‌های زیادی قرار گرفته است. در مطالعات همگروهی آینده‌نگر و مطالعات مورد شاهدی، فیبرینوژن پلاسما با بیماری عروق کرونر قلب رابطه‌ای مستقیم نشان می‌دهد، به طوری که در آخرین متا آنالیز انجام شده در این خصوص، خطر نسبی معادل 8/1 (با فاصله اطمینان 6/1 تا 2) محاسبه گردید. با این وجود باید در نظر گرفته شود که در افرادی که به آترواسکلروز مبتلا هستند، میزان فیبرینوژن پلاسما افزایش یافته و موجب ایجاد یک علیت معکوس بین بیماری و مواجهه می‌گردد. ضمناً عوامل مخدوش‌گری مثل مصرف سیگار و الکل، وضعیت اجتماعی اقتصادی و ... نیز ممکن است موجب اشتباه در نتیجه‌گیری محققین شوند. برای نتیجه‌گیری دقیق‌تر، می‌توان از تصادفی‌سازی مندلی کمک گرفت. پلی‌مورفیسمی بر روی ژن بتا-فیبرینوژن وجود دارد که بر روی سطح فیبرینوژن پلاسما اثرگذار است. سطح فیبرینوژن پلاسما در افراد با ژنوتیپ G/G g/l1/3، در افراد با ژنوتیپ A/G g/l22/3، و در افراد با ژنوتیپ A/A g/l36/3 می‌باشد، به طوری که هر آلل A موجب افزایشی معادل g/l 12/0 می‌گردد. اخیراً یک مطالعه مورد-شاهدی بزرگ بر این اساس انجام شده است که در دو مرحله، یکبار رابطه بین سطح فیبرینوژن پلاسما و CHD و بار دیگر رابطه بین داشتن ژنوتیپ A/A و CHD آزمون گردید. در بررسی رابطه بین سطح فیبرینوژن پلاسما و CHD، خطر نسبی معنی‌داری معادل 2/1 (با فاصله اطمینان 13/1 تا 26/1) مشاهده شد، در صورتی که در بررسی رابطه بین داشتن ژنوتیپ A/A و CHD خطر نسبی 03/1 (با فاصله اطمینان 96/0 تا 1/1) محاسبه گردید که معنی‌دار نبود. بنابراین به نظر می‌رسد که نتایج معنی‌دار حاصل از مطالعات مشاهده‌ای، ناشی از عوامل مخدوش‌کننده بوده و رابطه‌ای بین سطح فیبرینوژن پلاسما و بیماری عروق کرونر قلب وجو ندارد. محدودیت‌های تصادفی‌سازی مندلی: یکی از مهمترین محدودیت‌های اجرای این روش، محدودیت در یافتن پلی‌مورفیسم‌های عملکردی می‌باشد که بتواند اثر یک مواجهه محیطی خاص را شبیه‌سازی نماید. با این وجود، گسترش بسیار سریع دانش بشر می‌تواند به یافتن چنین واریته‌هایی کمک زیادی نماید. در حال حاضر امکان جستجوی چنین پلی‌مورفیسم‌هایی در نسخه آنلاین وراثت مندلی در انسان ، بانک اطلاعات موتاسیون ژنی انسان ، و بانک اطلاعات تفاوت‌های ژنوم انسان وجود دارد. یکی دیگر از محدودیتهای مهم این مطالعات، احتیاج آن به حجم نمونه بسیار بالا برای فراهم نمودن قدرت کافی آزمون می‌باشد. این موضوع از آنجا ناشی می‌شود که اغلب پلی‌مورفیسم‌های به کار گرفته شده در تصادفی‌سازی مندلی، تنها موجب تغییرات بسیار اندک در عملکرد مورد نظر می‌شوند. به عنوان مثال در مطالعه رابطه بین هوموسیستئین پلاسما و افزایش خطر ابتلا به CHD که پیشتر ذکر شد، برای انجام یک آزمون با قدرت 80% در سطح معنی‌داری 5%، نیاز به حداقل 9500 نفر مورد مبتلا به CHD و 9500 نفر شاهد می‌باشد. ضمناً باید در نظر داشت که در تصادفی‌سازی مندلی، مقادیر خطر نسبی محاسبه شده نیز اغلب کوچک می‌باشند. شاید یکی از دلایل زیاد بودن سوگرایی انتشار در مطالعات ژنتیکی انجام شده بر پایه تصادفی‌سازی مندلی، همین نیاز به داشتن حجم نمونه بالا باشد. یکی دیگر از مشکلاتی که ممکن است در تصادفی‌سازی مندلی رخ دهد این است که گاهی اوقات پلی‌مورفیسم مورد مطالعه، در عدم تعادل پیوستگی با یک پلی‌مورفیسم عملکردی دیگر قرار دارد. به عبارت دیگر در چنین مواردی وراثت این دو پلی‌مورفیسم مستقل از یکدیگر نیستند. ممکن است پلی‌مورفیسمی که با پلی‌مورفیسم مورد نظر ما رابطه دارد، مستقیماً روابط مورد مطالعه ما را تحت تاثیر قرار داده و یا بصورت غیر مستقیم از طریق اثر روی رفتار افراد (مثلاً مصرف سیگار و الکل، قدرت یادگیری و ...) موجب ایجاد سوگرایی در مطالعه گردد. بهترین حالت برای انجام یک تصادفی‌سازی مندلی در مواقعی است که یک پلی‌مورفیسم ژنی تنها سبب ایجاد یک فنوتیپ اثرگذار بر روی بیماری مورد نظر گردد. اجرای تصادفی‌سازی مندلی با استفاده از پلی‌مورفیسم‌هایی که همزمان موجب ایجاد چندین فنوتیپ اثرگذار روی بیماری شده و چندین عضو را تحت تاثیر قرار می‌دهند، کمتر توصیه می‌شود زیرا احتمال سوگرایی بیشتری داشته و تفسیر نتیجه‌گیری نهایی را دشوار می‌سازند. در مجموع در صورت وجود پلی‌مورفیسم عملکردی مناسب و حجم نمونه کافی، می‌توان از تصادفی‌سازی مندلی به عنوان روشی مطمئن و قابل اطمینان به منظور بررسی رابطه بین یک مواجهه و پیامد خاص، بدون ترس از اثر مخدوش‌کننده‌ها استفاده نمود. منبع: 1. Smith GD, Ebrahim S. 'Mendelian randomization': can genetic epidemiology contribute to understanding environmental determinants of disease? International journal of epidemiology. 200332(1):1-22. Epub 2003/04/12.